生命的產(chǎn)生是一個神奇的過程，經(jīng)歷了受精卵分裂、胚胎發(fā)育和胎兒生長。其間伴隨著全身器官的發(fā)育和成熟，以及成百上千種細(xì)胞的擴(kuò)增和分化，這決定了生物體的后期功能。

近日，美國洛克菲勒大學(xué)助理教授曹俊越因其在高通量單細(xì)胞測序技術(shù)以及發(fā)育生物學(xué)方面的成就，成為《科學(xué)》和SciLifeLab頒發(fā)的2020年度青年科學(xué)家獎特等獎全球唯一得主。11月20日，《科學(xué)》刊登了其獲獎短文，描述了有助于研究生命產(chǎn)生奧秘的4項高通量單細(xì)胞測序技術(shù)。

之前，11月13日，《科學(xué)》還刊登了洛克菲勒大學(xué)、華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院、羅特曼·巴蒂研究所等機(jī)構(gòu)研究人員利用這些新技術(shù)創(chuàng)造的兩個細(xì)胞圖譜，以追蹤人類細(xì)胞類型和組織發(fā)育過程中的基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性。

從失敗中完善

“細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的最基本單位，為了解生命的產(chǎn)生過程，我們需要系統(tǒng)性地分析人體每一種細(xì)胞種類及其在發(fā)育過程中的動態(tài)變化和分子機(jī)理。”曹俊越在接受《中國科學(xué)報》專訪時表示，而傳統(tǒng)手段受限于檢測的靈敏性，無法對人體的幾百種細(xì)胞進(jìn)行全面檢測和比較。

近幾年，單細(xì)胞測序技術(shù)，尤其是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，通過同時檢測單細(xì)胞幾萬種基因的表達(dá)，精確定義了細(xì)胞的分子學(xué)狀態(tài)，從而被廣泛應(yīng)用于檢測新的細(xì)胞種類，以及研究發(fā)育和疾病對細(xì)胞狀態(tài)的影響。但目前的單細(xì)胞測序技術(shù)只能檢測幾千個細(xì)胞，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常人體組織包含的細(xì)胞數(shù)目(百萬級)，同時耗材費用昂貴，因此無法全面檢測人體組織中的細(xì)胞種類和變化。

為了解決這一問題，在華盛頓大學(xué)Jay Shendure實驗室4年讀博研究期間，曹俊越研發(fā)了高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(sci-RNA-seq)等4項高通量單細(xì)胞測序技術(shù)。

“相對于傳統(tǒng)的生物學(xué)領(lǐng)域，新技術(shù)研發(fā)的困難主要在于要發(fā)明自然界中不存在的新事物，因此這一過程風(fēng)險很高，往往要經(jīng)歷很多失敗和挫折。”曹俊越回憶道，在研發(fā)sci-RNA-seq的最初過程中，他用兩年時間反復(fù)嘗試了262種實驗條件才摸索出最初的技術(shù)雛形。

之后，研究人員又實驗了超過1718種條件組合來優(yōu)化sci-RNA-seq，從而使這項技術(shù)可以真正用來分析上百萬個單細(xì)胞的基因表達(dá)圖譜。“大部分的實驗都沒有成功，但是沒有這些失敗和汗水，也就沒有最終完善的技術(shù)。”曹俊越說。

終于，基于組合標(biāo)記的sci-RNA-seq實現(xiàn)了不依賴于細(xì)胞分離的單細(xì)胞基因表達(dá)檢測。

4項技術(shù)

sci-RNA-seq被用于檢測超過5萬個線蟲單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序，從而構(gòu)建了世界首個生物個體水平的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。研究人員繪制了27個主要細(xì)胞種類的基因表達(dá)圖譜，并監(jiān)測到各種罕見的神經(jīng)細(xì)胞種類。這些數(shù)據(jù)不僅在線蟲研究領(lǐng)域具有重大意義，而且為構(gòu)建其他生物物種的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜提供了模板。

相對于線蟲，哺乳動物包括人的發(fā)育過程涉及更加多樣的細(xì)胞類型和復(fù)雜的分子程序。曹俊越等人研發(fā)了另一項高通量單細(xì)胞測序技術(shù)：sci-RNA-seq3。該技術(shù)可以同時檢測幾百萬個單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，其費用是以往技術(shù)的1/10。同時這項技術(shù)不依賴于特殊的儀器設(shè)備，可以廣泛應(yīng)用于世界大部分研究機(jī)構(gòu)。

研究人員首先用這項技術(shù)對小鼠主要器官的發(fā)育階段(胚胎期9.5天至13.5天)進(jìn)行高精度單細(xì)胞水平的系統(tǒng)性研究。他們一共檢測到200萬個單細(xì)胞組成的500多個細(xì)胞種類，并系統(tǒng)性繪制了形成各種器官的細(xì)胞分化路徑以及每個路徑中幾萬種基因的表達(dá)變化。

針對目前大部分單細(xì)胞測序技術(shù)只能檢測基因表達(dá)而忽略其他分子水平變化的局限，曹俊越等人又研發(fā)了高通量單細(xì)胞雙圖譜測序技術(shù)sci-CAR，可以同時檢測上萬個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)，并成功構(gòu)建首個哺乳動物器官水平(腎臟)的單細(xì)胞雙圖譜。

此外，目前的單細(xì)胞測序技術(shù)依然局限于描述細(xì)胞的靜態(tài)而忽略了動態(tài)變化。延時顯微鏡可以通過實驗測量細(xì)胞的動態(tài)轉(zhuǎn)變，但僅限于研究培養(yǎng)皿中少數(shù)細(xì)胞的少數(shù)標(biāo)記基因，因此可能不足以解釋許多生物系統(tǒng)的復(fù)雜性。為此，曹俊越發(fā)明了sci-fate技術(shù)，用于研究大量單細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組水平的基因表達(dá)動態(tài)。這項技術(shù)通過結(jié)合sci-RNA-seq和4-硫尿苷(4sU)標(biāo)記新生mRNA技術(shù)，可以大規(guī)模分析幾千到幾百萬個單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。

2017年至2020年，上述幾項成果發(fā)表于《自然》《科學(xué)》和《自然—生物技術(shù)》。

兩個圖譜

近日，研究人員使用這些技術(shù)，繪制了兩份新的圖譜：15種胎兒組織單個細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)圖譜和細(xì)胞內(nèi)單個基因染色質(zhì)可及性圖譜。

基因表達(dá)是細(xì)胞使用儲存在DNA中的指令指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的過程。而這些蛋白質(zhì)又決定了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。基因表達(dá)圖譜繪制了不同類型細(xì)胞生長發(fā)育過程中發(fā)生基因表達(dá)的時間和地點。

華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因組學(xué)教授Jay Shendure告訴記者：“這一領(lǐng)域的總體目標(biāo)是在盡可能大的范圍內(nèi)，以盡可能高的分辨率描繪人體遺傳程序。”

為了繪制圖譜，研究人員使用sci-RNA-seq3技術(shù)，對15種胎兒組織的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。科學(xué)家分析了400多萬個單細(xì)胞，確定了77種主要細(xì)胞類型和大約650個細(xì)胞亞型。研究發(fā)現(xiàn)了一些新的細(xì)胞種類，并綜合分析了主要細(xì)胞類型(包括血液、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞)的器官特異性。

他們將人類胎兒單細(xì)胞圖譜和小鼠胚胎細(xì)胞圖譜整合在一起，并構(gòu)建了細(xì)胞和基因從胚胎到胎兒發(fā)育的動態(tài)軌跡。華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因組學(xué)副教授Cole Trapnell表示：“把這些數(shù)據(jù)和之前發(fā)表的數(shù)據(jù)結(jié)合起來，可以直接描繪出所有主要細(xì)胞類型的細(xì)胞發(fā)育路徑。”

第二份DNA可及性圖譜繪制了一種名為染色質(zhì)的物質(zhì)，這種物質(zhì)允許DNA緊密地排列在細(xì)胞核內(nèi)。“研究染色質(zhì)能讓你了解細(xì)胞的調(diào)控‘語法’。”亞利桑那大學(xué)助理教授Darren Cusanovich說。

在這項研究中，科學(xué)家在15種胎兒組織的約100萬個位點上生成了近80萬個單細(xì)胞染色質(zhì)可及性圖譜。他們分析了哪些蛋白質(zhì)可能與每個細(xì)胞中的DNA位點相互作用，以及這些相互作用如何解釋細(xì)胞類型。這種分析定義了基因組內(nèi)發(fā)育的控制開關(guān)。他們還確定了染色質(zhì)易接近的位點，這些位點可能與疾病有關(guān)。

“每一項新技術(shù)都是一扇新的窗戶，使我們可以領(lǐng)略這個世界獨一無二的風(fēng)景。通過研發(fā)更先進(jìn)的技術(shù)，我們可以不斷超越前人和自己的局限性，同時用這些新技術(shù)探索生命的奧秘和美麗。”曹俊越說。(記者 唐鳳)

關(guān)鍵詞： 單細(xì)胞